磺酰胺基团是许多药物中的关键药效团，其中七元环状磺酰胺化合物因其结构和生物学特性而备受重视。然而生物催化合成手性环状磺酰胺化合物的研究仍较少。近日，江南大学生命科学与健康工程学院周志教授组联合厦门大学王斌举教授组在知名期刊ACS Catalysis上发表了题为“Enantioselective Biocatalytic Mannich Reaction for the Synthesis of Cyclic Sulfonamides by an Artificial Enzyme”的研究论文。该研究报道了一种含非天然仲胺催化中心的人工酶，通过烯胺催化机制活化环己酮类化合物，实现了环状酮与环状亚胺之间的不对称曼尼希反应。经过多轮迭代工程优化，最优变体能够以高立体选择性和高反应活性合成手性七元环状磺酰胺产物。利用动力学模拟和QM/MM计算揭示了关键的活性位点相互作用和过渡态特征。这项工作建立了一种手性环状磺酰胺的生物催化制备方法，并突显了共价锚定策略人工酶在实现非天然反应的巨大潜力，这些转化在药物化学领域具有潜在的应用价值。
磺酰胺基团是一种具有特殊药理活性的结构单元，广泛存在于临床药物中。经典的磺胺类抗生素，如磺胺甲噁唑，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出广谱抗菌活性。七元环磺胺基团在生物活性分子中较为常见，因其独特的结构和构象特征在药物化学中构成了重要的药效团单元。曼尼希反应是有机化学中一种经典的C–C键形成反应，广泛用于合成手性β-氨基化合物。尽管曼尼希反应在有机催化领域已得到了广泛的发展，但关于酶催化曼尼希反应的研究却相对较少。研究人员报道了一例天然曼尼希酶LolT的发现，这是一种吡哆醛-5'-磷酸（PLP）依赖性酶，可催化立体选择性的分子内和分子间曼尼希反应。总体而言，关于天然或人工酶催化的曼尼希反应的研究仍较为匮乏。因此，开发更多类型的曼尼希酶对于实现多样性手性β-氨基羰基类化合物的高效生物合成有着重要的意义。
图1 人工酶催化实现磺酰胺类化合物的不对称合成
基于课题组之前成功构建的人工酶体系。本研究中使用的蛋白骨架为乳酸乳球菌多药耐药性调节剂（LmrR），非天然吡咯烷催化中心可以在温和的条件下，通过吡咯烷二硫化物共价修饰半胱氨酸残基而高效引入可成功构建含非天然仲胺催化中心的人工酶。对于曼尼希反应的设计，环己酮1a与七元环状亚胺2a被选择为模板底物，基于前期研究基础，作者从LmrR_Cys_SA的酶库中筛选到LmrR_M89C_L57A_SA (LmrR_89SA_1.0) 展示出相较于各空白组对照较好的立体选择性与产率（99%产率，68.5:31.5 e.r.，12:1 d.r.），产物绝对构型最终确定为(2S, 1’R)。
图2 人工酶催化反应筛选
后续作者验证使用细胞裂解液代替纯化酶的情况下，人工酶构建依然可行且催化反应仍具备立体选择性。后续基于粗酶筛选体系，并结合MD模拟结果，经4轮定向进化获得的最优变体LmrR_89SA_5.0在优化条件下可实现>99%产率，95.5:4.5 e.r.，>20:1 d.r.以合成目标产物3a（图3）。动力学结果表明，LmrR_89SA_5.0的催化效率（kcat/KM）为LmrR_89SA_1.0的3.5倍。
图3 人工酶定向进化
为了阐明人工曼尼希酶 LmrR_89SA_5.0 所表现出的高立体选择性的起源，作者结合了分子动力学（MD）模拟和量子力学/分子力学（QM/MM）计算。分子对接及随后的分子动力学模拟考虑了底物可能的四种结合构象，它们分别对应于 R-R、S-R、S-S 和 R-S 产物立体异构体。对C1-C2距离波动的分析表明，只有与S-R产物相关的结合构象在酶的活性口袋内保持稳定。关键氨基酸残基的作用也可能通过稳定中间体的构象来影响反应的立体选择性。为了验证其作用，将丙氨酸突变引入了Asn14、Arg10和Arg56残基中——这些残基在分子动力学模拟结果中位于底物4 Å范围内，并与反应中间体形成氢键。结果表明 N14 起着关键作用，这体现在 N14A 突变体的立体选择性从91% 下降至35%。为了全面评估形成其他可能的异构体的可行性，作者还对R-R产物构象进行了QM/MM计算。选取了从相应的分子动力学轨迹中提取的、C1-C2距离为5.78 Å的代表性结构作为起点。随后的势能面扫描显示，R-R路径存在一个显著较高的能量障碍，为38.9 kcal/mol。该能垒远高于S-R产物路径的计算值，表明R-R路径在动力学上极不受青睐。这一结果与实验观察到的立体选择性非常吻合，为该酶对S-R 产物的特异性催化提供了有力的计算证据。
图4 酶催化反应机制解析
本文报道了一例人工酶催化环状酮与环状磺酰亚胺之间的不对称曼尼希反应，高效合成了具有两个手性中心和轴手性中心的对映体富集的七元环状磺酰胺。通过迭代定向进化，获得了能够以极佳收率（高达>99%）、高对映体选择性（高达95.5:4.5 e.r.）和异构体选择性（>20:1 d.r.）生成目标产物的变体。结合分子动力学（MD）模拟和QM/MM计算，阐明了导致所观察到的立体控制的关键活性位点相互作用和过渡态特征。这项工作拓展了基于胺催化中心人工酶的反应类型与应用范围，并为结构独特的手性环状磺酰胺类化合物的高效生物合成提供了新的策略。
这一成果近期发表在ACS Catalysis上，江南大学生科院周志教授和厦门大学王斌举教授为论文共同通讯作者，江南大学生科院博士生朱致熹、硕士生胡沁汝和厦门大学博士后吴瑶为论文共同第一作者。工作得到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金等项目的支持。
文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.6c03969
